BD寡核苷酸（人）免疫检测组合

在一次实验中发现多达30种免疫标记物

BD^® AbSeq Immune Discovery Panel（IDP）是基于抗体-寡核苷酸的技术开发的，包含30种针对主要人类主要特异性免疫标记物的抗体，这些抗体以冻干粉形式混合于单个管中。BD^® AbSeq IDP经测试可检测人类免疫标记物，设计用于BD Rhapsody™ 单细胞分析系统，配有BD Rhapsody ™ 单细胞RNA试剂盒和BD^®混样试剂盒。

从BD^®AbSeq IDP中查找更多信息。

BD^®AbSeq IDP特异性列表

30份预滴定抗体


特异性	克隆	寡核苷酸 ID
CD3	UCHT1	AHS0231
CD4	SK3	AHS0032
CD8	SK1	AHS0228
CD11c	B-Ly6	AHS0056
CD14	MPHIP9	AHS0037
CD16	3G8	AHS0053
CD19	SJ25C1	AHS0030
CD25	2A3	AHS0026
CD27	M-T271	AHS0025
CD28	L293	AHS0138


特异性	克隆	寡核苷酸 ID
CD45RA	HI100	AHS0009
CD56	NCAM16	AHS0019
CD62L	DREG-56	AHS0049
CD127	HIL-7R-M21	AHS0028
CD134	ACT35	AHS0013
CD137	4B4-1	AHS0003
CD161	HP-3G10	AHS0205
CD183 (CXCR3)	1C6/CXCR3	AHS0031
CD185 (CXCR5)	RF8B2	AHS0039
CD186 (CXCR6)	13B 1E5	AHS0148


特异性	克隆	寡核苷酸 ID
CD196 (CCR6)	11A9	AHS0034
CD197 (CCR7)	2-L1-A	AHS0273
CD272	J168-540	AHS0052
CD278	DX29	AHS0012
CD279	EH12.1	AHS0014
CD357 (GITR)	V27-580	AHS0104
CD366 (TIM-3)	7D3	AHS0016
HLA-DR	G46-6	AHS0035
IgD	IA6-2	AHS0058
IdM	G20-127	AHS0198

BD^®AbSeq IDP 操作步骤

按照以下简单步骤使用BD^®AbSeq IDP：

重组冻干IDP和染色

从箔袋中取出IDP管，并将其加热至室温，持续5分钟。
确保干粉位于管子底部。
向管子底部添加35µL无核酸酶水，并使抗体在室温下重组5分钟。
抗体置于冰上，直至细胞可以染色。注：重组抗体应在24小时内使用。
为制备2X AbSeq标记反应混合物，向溶液中添加65 µL BD Pharmingen™染色缓冲液，使其总体积达到100 µL。
用BD^®AbSeq抗体-寡核苷酸进行单细胞标记后，与制备的100 µL细胞悬浮液混合（文件ID 214394版本1.0），并将细胞在冰上染色30分钟。
向标记细胞和移液管混合液中加入3 mL BD Pharmingen™染色缓冲液（FBS）。
以400 x g速度离心各管5分钟。
打开每个管的盖子，倒置，将上清液倒入生物危害性废物中。将试管倒置，用无绒布轻轻擦拭，去除试管边缘残留的上清液。
再重复步骤7-9两次，共洗三次。
从BD Rhapsody™ Cartridge试剂盒将小球重新悬浮在620 µL BD Pharmingen™冷染色缓冲液（FBS）中，并进行单细胞捕获。

请参阅BD Rhapsody™系统的单细胞分析工作流（文档ID：220524）。

性能

新制备BD^®AbSeq试剂30种特异性混合物，其生成的数据可与BD^®AbSeq IDP试剂盒的对应数据进行比较。

IDP与新混合的BD^®AbSeq抗体的相似性能。从全血中分离后，将外周血单核细胞（PBMC）分为静止组（未处理）和激活组（用CD3/CD28处理24小时）。对静止细胞和激活细胞的1:1混合物，用IDP或新制备的AbSeq特异性混合物进行染色。然后将相同数量的细胞加到BD Rhapsody™ Cartridges上，生成AbSeq和WTA文库并测序（本研究中n=2个单独实验）。采用SeqGeq™ 软件和Dataview软件进行数据分析。

A.在IDP和新鲜BD^®AbSeq抗体染色样品的细胞群中，UMAP显示出强烈的重叠。

B. IDP和新鲜BD^®AbSeq抗体混合物检测到的AbSeq分子总数与R²的相关性很高，大于0.98。

当针对来自多个供体的PBMC进行检测时，BD^®AbSeq IDP中30种特异性都能可靠地检测各自的靶点。

IDP中所有30种AbSeq特性的性能。如上图所述，制备PBMC，染色后，在BD Rhapsody™系统上捕获细胞，生成AbSeq和WTA文库并测序。为了使测序饱和度超过80%，使用Illumina™ NextSeq™高通量试剂盒对文库进行测序，WTA为20,000 reads/细胞，AbSeq为30,000 reads/细胞。采用SeqGeq™ 软件和Dataview软件进行数据分析。我们用至少两个不同的Donor 样本重复了上述实验。一个供体的代表结果如下。

A. 通过IDP抗体和WTA mRNA谱，解析静息+激活PBMC的UMAP细胞注释。

B. UMAP上来自(A)的来自IDP的每个AbSeq克隆的热图，显示AbSeq检测对各细胞类型的特异性。

向IDP添加更多BD^® AbSeq抗体, 不会影响BD^® AbSeq IDP或添加抗体的特异性。

IDP设计灵活，在此panel上可添加其它AbSeq抗体。添加三种BD^®AbSeq抗体并与重组IDP小球混合（n=2）。

A. 如高相关性（R2大于0.99，有或没有插入）所示，IDP结果不受其它抗体的影响。B. 相对于CD8[RPA-T8]、CD45RO和CD38（底行）插入的特异性，对CD8[SK1]和CD45RA（顶行）的IDP特异性进行了评估，运行UMAP。添加CD38的组检测到CD38应阳性的细胞类型。添加CD8（RPA-T8）的组显示出与IDP克隆（SK1）非常相似的结果，表明添加的抗体有高度特异性以及两个克隆对相同抗原有相容性。CD45RO添加与CD45RA（IDP）表达模式的对比进一步证实，将其它AbSeq添加到IDP实验结果显示互不影响。

BD^®AbSeq IDP可与BD Rhapsody™ RNA试剂盒和BD^®混样试剂盒无缝配合使用。

IDP与 RNA和混样联合分析。

A. 从IDP染色细胞（静息PBMC和激活PBMC的1:1混合物）产生WTA和AbSeq文库并测序。为了显示多组学分析的优势，我们只分析了WTA数据（mRNA分析），并与WTA+AbSeq数据共同分析（mRNA和蛋白质分析）进行了比较。左侧显示仅使用WTA（mRNA）数据的UMAP坐标和分群结果（Phenograph），右侧显示使用WTA+AbSeq（mRNA和蛋白质）数据的坐标和注释。通过多组学方法，发现了更多的细胞类型，加深了生物学认识。

B. 为了检测BD^®单细胞混样试剂盒（SMK）和IDP的兼容性，我们将SMK和IDP一起进行细胞染色，并生成WTA、AbSeq和SMK文库进行测序。然后将IDP中标记物的表达与无SMK情况下产生的数据进行比较。这些数据表明，添加SMK不会影响IDP，IDP+WTA vs IDP+WTA+SMK之间的高相关性（R2>0.99）证明了这一点。