High-parameter 유세포 분석기를 이용한 COVID-19 환자의 NK cell immunotyping

SARS-CoV-2 감염은 다양한 면역반응을 유도하여 선천면역 및 적응면역체계를 모두 활성화시킵니다. 이러한 면역 반응이 표적화 및 control 되는지 또는 오도(misdirected)되어 control 되지 않는지에 따라 질병의 결과가 달라질 수 있습니다. Deep immunoprofiling을 이용한 최근 연구에서는 면역반응의 특성이 질병의 중증도를 결정할 수도 있음을 시사했습니다  . 예를 들어 인터페론 반응이 제대로 시작되지 못하는 것은 IL-6 레벨의 증가, 그 이후 cytokine storm과 COVID-19 질환의 중증도와 연관성이 있습니다. 후천성 면역반응과는 달리 아직 SARS-CoV-2에 대한 선천면역 반응에 대해 상세한 연구는 진행되지 않았습니다.

NK cell과 급성 바이러스 감염에서 NK cell의 역할

선천면역체계의 일부인 NK cell은 감염된 세포를 공격하고 파괴하는 능력이 있으며 T cell-mediated 적응면역 반응에 영향을 줄 수 있습니다.  두 개의 주요 NK cell population은 CD56^bright NK cell (cytokine 생성) 및 CD56^dim NK cell(cytotoxic)입니다. NK cell의 critical threshold 수준을 기반으로 방어적인 면역 반응 또는 immunopathology가 유발될 수 있습니다. NK cell은 다양한 유형의 바이러스 감염에 신속하게 반응하는 것으로 나타났습니다. 다른 면역세포에 비해 COVID-19 감염증에서 NK cell의 관여 및 특징에 대한상세한 연구는 진행되지 않았습니다. 

Maucourant et al.은 간행물 “COVID-19 감염증의 중증도와 관련된 NK cell의 immunophenotype”에서 high-parameter 유세포 분석과  unsupervised 분석을 사용하여 SARS-CoV-2 감염 반응에 대한 NK cell의 관여 및 NK cell의 활동과 COVID-19 감염증 중증도 간의 상관관계를 이해하고자 했다. 연구팀은 COVID-19 중등증 환자(n=10) 및 COVID-19 중증환자(n=17) 집단, SARS-CoV-2 IgG 혈청 음성이며 무증상인 사람들로 구성된 control group의 말초혈액 mononuclear cell을 분석했습니다.

이 연구를 통해 COVID-19 감염증에서 NK cell 활성화와 관련한 몇 가지 주요 패턴과 세부사항이 밝혀졌습니다.

• 28-color NK cell-focused flow cytometry panel을 이용한 분석에서 건강한 control group에 비해 COVID-19 환자에서 NK cell이 고도로 활성화되었습니다. 그러나 활성화 수준은 질병 중증도와 직접적인 상관관계가 없었습니다. CD56^bright 및 CD56^dim NK cell의 분석을 통해 control group에 비해 COVID-19 환자에서 이러한 cell및 전체 NK cell의 absolute count가 감소한 것을 알 수 있었습니다.
• 주요 성분 분석을 통해 control group에 비해 환자 집단에서 뚜렷한 cluster를 확인할 수 있었습니다. NK cell population (CD56^bright NK cell에서 CD98, Ki-67, Ksp37, CD56^dim NK cell에서 Tim-3, CD98, CD38, CD69, Ksp37) 과 관련된 여러 marker 발현에 차이를 보였습니다.
• 반응하는 CD56^bright 와 반응하지 않는 CD56^bright cell 간 marker 발현에 차이가 있었으며 반응하는 CD56^dim NK cell과 반응하지 않는 CD56^dim NK cell도 마찬가지로 marker 발현에 차이를 보였습니다.
• 차등발현된 유전자의 single-cell RNA sequencing  과 gene ontology enrichment 분석을 통해 effector function, 활성화, 증식, 인터페론 반응 등 여러 parameter로 환자와 control group 간 뚜렷한 유전자 모듈을 알 수 있었으며 control group에 비해 환자군에서 발현이 증가함을 알 수 있었습니다.
• 기관지 폐포 fluid  분석에서는 인터페론 반응, 활성화/증식 signature, 차등발현과 관련하여 활성화 및 염증 profile이 나타났습니다.
• 억제 수용체 발현 및 NK 세포 분석을 통해 환자의 NK CELL 활성화는 inhibitory KIR 발현 및 NK 세포 학습과 무관한 것으로 밝혀졌습니다.
• COVID-19 중등도 환자에 비해 중증 환자에서 적응 NK cell (NKG2C+CD57+CD56^dim NK cells)의 발견 빈도가 높게 나타났습니다. 이는 증식 및 활성화 marker이며, 적응 NK cell 확장이 환자의 CMV 재활성화와는 관계가 없는 것으로 보였습니다.
• 이 논문에서는 처음으로 COVID-19에서 NK-cell의 확장이 증가했음을 나타냈습니다.
• FlowJo™ v10.6.2 Software, FlowAI, DownSample, Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP), PhenoGraph plugins로 unsupervised 접근법을 사용한 유세포 분석을 통해 NK cell population의 여러 cluster를 확인할 수 있었습니다. 뚜렷한 임상 카테고리를 기반으로 한 PhenoGraph clustering과 stratification을 통해 질병 phenotype과 연관성이 있을 수 있는, 상대적으로 뚜렷한 marker가 상당히 존재하는 36개의 cluster가 확인됐습니다.
• 상대적으로 풍부한 PhenoGraph 클러스터로 중등도 및 중증 immunotype으로 구분되었습니다.
• 중등도와 중증 immunotype분석을 통해 MIP-1β, CD98, TIGIT와 같은 marker가 중등도 immunotype에서 upregulated 된 반면, perforin, NKG2C, Ksp37와 같은 marker는 중등 immunotype에서 증가했음을 알 수 있었습니다.
• NK cell 반응에 대한 보다 상세한 분석을 통해 CD56^bright cell에서 perforin과 granzyme B 발현 수준이 중증 COVID-19 환자 phenotype(순차적인 장기부전 평가 및 지속적인 혈청 내 SARS-CoV-2 바이러스 혈증 포함)과 양의 상관관계가 있음을 밝혔습니다. 또한 CD56^bright cell에서 이러한 marker들의 upregulation 역시 다양한 effector molecule 수준 증가와 양의 상관관계가 있었으며, TIGIT와 같은inhibitory check-point molecule과는 음의 상관관계가 있었습니다.
• COVID-19 환자의 soluble serum protein 분석 결과, 이들 중 일부는 CD56^bright cell에서의 perforin과 granzyme B 발현과 연관성이 있는 것으로 나타났습니다. 여러 soluble factor들이 다른 바이러스 감염과도 연관성이 있었으며 이는 NK cell 활성화  pathway가 다양한 바이러스 감염 반응  pathway와 공용으로 사용될 수 있다는 것을 의미합니다.

이러한 결과는 COVID-19 환자의 초기 NK cell 반응, 질병 진행에 따른 면역 반응 변화를 이해하는데 대한 지식을 제공해주었습니다.

적응 NK cell expansion,  CD56^bright cell의 arming과 질병 중등도와의 상관관계 유의성은 환자에게 관찰된 pro-inflammatory cytokine 수준 증가와 관련하여 추가적인 연구가 필요합니다. SARS-CoV-2  감염 중 선천면역 반응을 보다 잘 이해하기 위해서는 Monocytes 및 neutrophils를 포함한 다른 선천면역 반응과의 관계에 대한 추가적인 연구가 필요합니다.

상세한 내용은 아래 논문 을 참조하십시오.